拳交 國產 胃癌单细胞数据集GSE163558复现（一）：数据下载、整理与读取

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引子

Hello小伙伴们人人好，我是生信手段树的小学徒”我才不吃蛋黄“。接下来的一段时辰里，将由我开启一个新的学徒共享系列，给人人系统整理单细胞测序的代码。此系列包括但不限于以下内容：数据下载与读取；质控和去批次；降维聚类；分群驻扎；各异分析；富集分析；拟时序分析；细胞通信；CopyKAT。

基本囊括了单细胞测序旧例分析的所有这个词法子，相配合适外行及初学者系统学习。因此，迎接人人合手续追更，温暖公众号，点赞+推敲+储藏+在看，您的饱读动将是我更新的能源，提前谢谢人人。

1.文献简介

本系列复现的文献题目为“Revealing the transcriptional heterogeneity of organ-specific metastasis in human gastric cancer using single-cell RNA Sequencing”。通信作家是浙江大学的范骁辉教会，于2022年发表在Clin Transl Med杂志（IF=10.6）。

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选录：

筹商：通过单细胞测序分析揭示胃癌(GC)过甚篡改的生物学特色。

法子:主如果收罗了6例患者共10个簇新组织标本（包括原发肿瘤、癌旁组织和不同器官或组织的篡改瘤）进行了单细胞测序期间。并使用组织学分析和Bulk转录数据集进行了考证。

效果：

恶性上皮亚群细胞与侵袭特征、腹膜内篡改倾向、上皮-间充质转动指令的肿瘤干细胞表型或睡觉样特征相关。基于TCGA胃癌部队的KM生涯分析效果表露，前三个恶性上皮亚群干系基因的是GC患者预后的风险因子。

免疫和基质细胞施展出细胞异质性，并创造了亲肿瘤和免疫扼制的微环境。

基于淋巴开端的耗竭CD8+T细胞的20个基因signature可展望胃癌淋巴篡改，该效果在并在TCGA部队中赢得了考证。

除恶性肿瘤细胞，还发现了一个内皮细胞亚群、粘膜干系不变T细胞、T细胞样B细胞、浆细胞样树突状细胞、巨噬细胞、单核细胞和中性粒细胞可能有助于与 细胞毒/亏本的CD8+T细胞 和/或 天然杀伤(NK)细胞相互作用（HLA-E-KLRC1/KLRC2），NKG2A(KLRC1)可能是胃癌调整新的靶点。

CD8+T细胞中PD-1的抒发可展望胃癌患者对PD-1扼制剂的临床响应。

论断：本议论对胃癌原发肿瘤和器官特异性篡改的异质性微环境提供了深远的意识，为准确的会诊和调整提供了赈济。

以上即是本文的简介拳交 國產，接下来咱们插足数据分析部分，启动下载并读取数据。

2.数据下载与整理

著作的单细胞测序数据存放于GEO数据库，编号为GSE163558（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE163558）。本数据集收录了6例胃癌患者共10个簇新组织标本（包括原发肿瘤、癌旁组织和不同器官或组织的篡改瘤）：

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不错看到，数据的文献局面为10X步调文献。10X步调文献包含cellranger上游比对分析产生的barcodes.tsv.gz，features.tsv.gz和matrix.mtx.gz 3个文献，分别代表细胞标签(barcode)、基因ID(feature)、抒发数据（matrix）。

在读取文献之前，咱们需要先加载R包：

rm(list=ls())options(stringsAsFactors = F) library(Seurat)library(data.table)library(dplyr)

下载数据之后，启动对原始文献进行处置，将原始文献分别整理为barcodes.tsv.gz，features.tsv.gz和matrix.mtx.gz并放到到各自的文献夹中。代码如下：

setwd("")  dir='GSE163558_RAW/' fs=list.files('GSE163558_RAW/'，'^GSM')fslibrary(tidyverse)samples=str_split(fs，'_'，simplify = T)[，1]##处置数据，将原始文献分别整理为barcodes.tsv.gz，features.tsv.gz和matrix.mtx.gz到各自的文献夹#批量将文献名改为 Read10X()函数梗概识别的名字lapply(unique(samples)，function(x){  # x = unique(samples)[1]  y=fs[grepl(x，fs)]  folder=paste0("GSE163558_RAW/"， paste(str_split(y[1]，'_'，simplify = T)[，1:2]， collapse = "_"))  dir.create(folder，recursive = T)  #为每个样本创建子文献夹  file.rename(paste0("GSE163558_RAW/"，y[1])，file.path(folder，"barcodes.tsv.gz"))  #重定名文献，并挪动到相应的子文献夹里  file.rename(paste0("GSE163558_RAW/"，y[2])，file.path(folder，"features.tsv.gz"))  file.rename(paste0("GSE163558_RAW/"，y[3])，file.path(folder，"matrix.mtx.gz"))})

3.数据读取与归拢

整理好10X步调文献后，使用Read10X()函数对这三个步调文献进行整合，赢得疏淡抒发矩阵（活动基因、列为细胞，dgCMatrix局面）。在疏淡抒发矩阵”tmp“的基础上，使用CreateSeuratObject函数构建Seurat对象。多个样本就需要对多个文献批量读取，在这里咱们使用了lapply函数（亦可使用for轮回）。

dir='GSE163558_RAW/'samples=list.files( dir )samples sceList = lapply(samples，function(pro){   # pro=samples[1]   print(pro)    tmp = Read10X(file.path(dir，pro ))   if(length(tmp)==2){    ct = tmp[[1]]   }else{ct = tmp}  sce =CreateSeuratObject(counts =  ct ，                          project =  pro  ，                          min.cells = 5，                          min.features = 300 )  return(sce)#复返创建的Seurat对象，将其存储在sceList中。}) View(sceList)

这里咱们赢得的sceList实质上包含了10个样本的Seurat对象，

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搜检其中一个：

PT1 <- sceList[1]View(PT1)

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不错看到，这是一个包含各样元素的Seurat V5对象（V5版块的assays对象底下多出了layers的结构）（笃定见之前推文https://mp.weixin.qq.com/s/2dtIS1qd0tPM1dQRCKptAQ）。

接着，咱们需要使用Seurat包的merge函数，将十个Seurat归拢成一个Seurat对象。

do.call(rbind，lapply(sceList， dim))sce.all=merge(x=sceList[[1]]，              y=sceList[ -1 ]，              add.cell.ids = samples  ) names(sce.all@assays$RNA@layers)

此时，天然咱们照旧完成了Seurat对象的创建，关联词不错看到，十个样本仍然有10个layers。如果不进一步处置，后续在索求counts时数据不完竣，分析会一直出错。因此咱们需要使用JoinLayers函数对layers进行归拢。

sce.all[["RNA"]]$counts # Alternate accessor function with the same resultLayerData(sce.all， assay = "RNA"， layer = "counts")#望望归拢前后的sce变化sce.allsce.all <- JoinLayers(sce.all)sce.all

这是整合之前的：

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这是整合之后的：

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不错看到在归拢Seurat和layers后，终于赢得了一个完竣的Seurat对象”sce.all“。咱们不错搜检”sce.all“里面的一些信息，以此来查验数据是否完竣。

dim(sce.all[["RNA"]]$counts )as.data.frame(sce.all@assays$RNA$counts[1:10， 1:2])head(sce.all@meta.data， 10)table(sce.all$orig.ident) length(sce.all$orig.ident)

咱们不错搜检每个样本的细胞数量及总的细胞数量：

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4.添加meta.data分组信息

在见效构建Seurat对象”sce.all“后，咱们还需要给样本添加meta.data分组信息，以便后续作念不同分组之间的对比以及索求亚组后进行进一步分析。当先，咱们搜检现存的meta.data信息有哪些：

library(stringr)phe = sce.all@meta.datatable(phe$orig.ident)View(phe)

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不错看到，现存的信息仅有：orig.ident(样品名)，nCount_RNA(每个细胞的UMI数量)和nFeature_RNA（每个细胞中检测到的基因数量）。但原文中包含有样本的患者开端，组织开端、篡改部位等信息，这些信息不错通过样本编号进行分裂。因此咱们不错欺诈文本处置函数”str_split“、”gsub“对患者编号进行处置，并添加以上信息到meta.data。

函数 str_split 用于拆分字符串：

phe$group = str_split(phe$orig.ident，'[_]'，simplify = T)[，2] 

添加篡改部位分组信息

phe$sample = phe$orig.identphe$sample = gsub("GSM\\d+_PT\\d+"， "GC"， phe$sample) phe$sample = gsub("GSM\\d+_LN\\d+"， "GC_lymph_metastasis"， phe$sample) phe$sample = gsub("GSM\\d+_O1"， "GC_ovary_metastasis"， phe$sample) phe$sample = gsub("GSM\\d+_P1"， "GC_peritoneum_metastasis"， phe$sample) phe$sample = gsub("GSM\\d+_Li\\d+"， "GC_liver_metastasis"， phe$sample) phe$sample = gsub("GSM\\d+_NT\\d+"， "adjacent_nontumor"， phe$sample) table(phe$sample)

添加患者开端信息

phe$patient = phe$orig.identtable(phe$patient)phe$patient = gsub("GSM5004180_PT1|GSM5004188_Li1"， "Patient1"， phe$patient) phe$patient = gsub("GSM5004181_PT2|GSM5004183_NT1"， "Patient2"， phe$patient) phe$patient = gsub("GSM5004186_O1"， "Patient3"， phe$patient) phe$patient = gsub("GSM5004185_LN2"， "Patient5"， phe$patient) phe$patient = gsub("GSM5004187_P1"， "Patient6"， phe$patient) phe$patient = gsub("GSM\\S+"， "Patient4"， phe$patient) table(phe$patient)

文中还有一类分群为渊博NT，原发PT，篡改M，用ifelse函数添加

phe$tissue <- ifelse(phe$orig.ident %in% c("GSM5004180_PT1"，"GSM5004181_PT2"，"GSM5004182_PT3")，"PT"，                ifelse(phe$orig.ident %in% c("GSM5004183_NT1")，"NT"，"M"))table(phe$tissue)sce.all@meta.data = pheView(phe)

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终末不错看到，咱们见效添加了所有这个词的样本信息。至此，数据下载、整理、读取收尾，接下来不错启动走卑鄙的Seurat V5步调进程。结语

本期咱们对文献选录进行了简要追念，下载了GSE163558胃癌数据集10个样本的10X局面的单细胞测序数据，并对文献进行了整理，在批量读取了10X文献后，进行了归拢并见效构建Seurat对象，在此基础上将患者的临床信息添加到meta.data分组信息中。下一期，咱们将在此基础上走Seurat V5步调进程，对Seurat对象进行QC质控、并欺诈harmony整合去批次、并按步调进程进行降维聚类分群。

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